近年來，人們越來越認(rèn)識到，除了藥物代謝酶以外，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在許多藥物的吸收、分布和排泄中發(fā)揮著重要的作用。由于多態(tài)性或藥物-藥物相互作用（DDI）導(dǎo)致的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能喪失已被證明會導(dǎo)致藥物處置、療效甚至毒性發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的重要性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)也期望新藥申請需進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)體的體外研究，以評估轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的DDI的潛在風(fēng)險。

轉(zhuǎn)運(yùn)體介紹

轉(zhuǎn)運(yùn)體（transporter）是一類表達(dá)于細(xì)胞膜的功能蛋白，在人體全身組織中均有表達(dá)，通過影響藥物的吸收、分布和消除而影響藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征。介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)體可將藥物攝取進(jìn)入組織器官，從而提升藥物生物利用度以及改變藥物的組織分布，屬于可溶性載體（Solute carrier，SLC）轉(zhuǎn)運(yùn)體；介導(dǎo)藥物外排的轉(zhuǎn)運(yùn)體可利用水解ATP的能量將某些藥物排出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，產(chǎn)生耐藥性，屬于ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體。

可溶性載體超家族是人類細(xì)胞膜上最重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體家族之一，它參與了細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸、能量傳遞、營養(yǎng)代謝、信號傳導(dǎo)等重要生理活動。SLC超家族包括 52個亞家族，共有 400多名成員。臨床應(yīng)用中與DDI有關(guān)的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體大多是攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic cation transporter, OCT)2；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporter, OAT) 1/3；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP) 1B1/1B3；寡膚轉(zhuǎn)運(yùn)體（oligopeptide transporter, PEPT)1 等。其中，多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（multidrug and toxin extrusion proteins, MATE) 1/2-K 是SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體，但屬于外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體。

ATP結(jié)合盒（ATP Binding Cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體是最大的轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族，分為ABCA~G共7個亞家族，屬于主動運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)體，依賴于ATP發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)活性，以逆濃度梯度形式將藥物排出體外。參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein，MRP)等。

圖1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在人體各組織器官中的分布

各國指導(dǎo)原則對轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的要求

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是決定細(xì)胞內(nèi)藥物積累的關(guān)鍵因素，其活性往往與藥物的治療效果、毒性及藥物-藥物相互用 (Drug-drug interaction，DDI) 直接相關(guān)。美國、歐洲和中國的藥品監(jiān)管部門也相繼出臺指導(dǎo)原則，建議體外評估主要轉(zhuǎn)運(yùn)體與受試藥物之間潛在的相互作用，為體內(nèi)研究提供參考。

表1 各國指導(dǎo)原則對轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的建議

“√"必須考慮；“×"不考慮

轉(zhuǎn)運(yùn)體研究體外模型

在開始轉(zhuǎn)運(yùn)體研究之前，一個重要的考慮就是選擇合適的體外試驗(yàn)系統(tǒng)。目前，指導(dǎo)原則推薦的體外評估由轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)等。

3.1 膜囊泡系統(tǒng)

轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的細(xì)胞的外翻膜囊泡系統(tǒng)是評價在研藥物是否為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（如P-gp、BCRP、BSEP等）的底物或抑制劑的常用模型。通常，膜囊泡可通過感染昆蟲細(xì)胞（如Sf9或Sf21），或轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等進(jìn)行制備。囊泡外翻后，原本表達(dá)在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體將被外翻至囊泡外，與藥物共孵育時，藥物直接作用于外翻轉(zhuǎn)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)，可檢測藥物的吸收而非外排，即測定囊泡內(nèi)藥物含量即可反應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體對藥物的作用。

圖2 膜囊泡系統(tǒng)的研究方案

3.2 基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

?

基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是指能夠自發(fā)極化形成完整細(xì)胞單層的細(xì)胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細(xì)胞接種在Transwell小室上，培養(yǎng)至形成完整的極化細(xì)胞單層，將受試藥物添加到單層細(xì)胞的頂端（apical，AP）或基底側(cè)（basolateral，BL），測量滲透入接收室中的藥量，根據(jù)AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）兩個方向上的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，Papp）計算外排率（efflux ratio，ER），評價化合物是否為該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體底物。此外，通過測量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化，也可以進(jìn)行化合物對特定轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用的評估。

3.3 單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)

將重組轉(zhuǎn)運(yùn)體基因穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染到不同的細(xì)胞系，可用于評價在研藥物是否為SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體（如OCTs、OATs、OATPs和MATEs）的底物或抑制劑。由于HEK293和CHO細(xì)胞具有低內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性并且易于維持的特點(diǎn)，常用于表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)評價藥物是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物時，應(yīng)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的藥物攝取與親代或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行比較，且應(yīng)比較有或無轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑時的藥物攝取。當(dāng)評估藥物是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑時，僅使用轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系評價已知探針底物的攝取便已足夠。

3.4三明治培養(yǎng)肝細(xì)胞

肝細(xì)胞中除了含有豐富的藥物代謝酶，還表達(dá)多種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。三明治培養(yǎng)是將肝細(xì)胞培養(yǎng)于兩層膠原之間，底層為鼠尾膠使肝細(xì)胞貼壁，上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)幾天后，肝細(xì)胞形成完整膽小管網(wǎng)絡(luò)并同時保持緊密連接，且肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體正常表達(dá)并定位于恰當(dāng)?shù)哪^(qū)域，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)體功能研究。

試驗(yàn)系統(tǒng)——膜囊泡

應(yīng)用

•評估藥物與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的相互作用

•確定底物特異性和確定抑制劑

優(yōu)勢

•適用于低通透性的化合物

•細(xì)胞毒性化合物不會影響實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

•重組系統(tǒng)中的高轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)可以在某些表達(dá)系統(tǒng)中“滴定"

•可以制備大量并冷凍保存以備隨時可用

•能夠預(yù)加載各種緩沖液和物質(zhì)

•準(zhǔn)確測定動力學(xué)，因?yàn)榉跤彌_液中的底物可以直接進(jìn)入活性位點(diǎn)

局限性

•不適合具有高滲透性或高非特異性結(jié)合的化合物

•昆蟲細(xì)胞中的低糖基化可能改變運(yùn)輸特性

•表達(dá)系統(tǒng)中的內(nèi)源性運(yùn)輸活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化•轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性因批次而異

•如果在室內(nèi)制備（超離心或氮空化彈），則需要特殊設(shè)備

試驗(yàn)系統(tǒng)——單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)

應(yīng)用

•評估藥物與攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OATPs,OCTs, OATs，NTCP）的相互作用

•確定底物特異性并確定抑制劑

優(yōu)勢

•允許調(diào)查單個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特性

•穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以傳代多次使用或冷凍保存

•低復(fù)雜性

局限性

•宿主細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化

•穩(wěn)定重組細(xì)胞系的產(chǎn)生和表征是耗時的（>1個月）

•轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)室之間有所不同

試驗(yàn)系統(tǒng)——基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

應(yīng)用

•評估外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)

•確定底物特異性并確定抑制劑

•定性地研究攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體之間的相互作用

優(yōu)勢

•運(yùn)輸受非特異性結(jié)合的影響較小，因?yàn)橹挥写┻^細(xì)胞單層的化合物才被測量

•適合評估主動運(yùn)輸與擴(kuò)散

局限性

•內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化

•需要評估質(zhì)量平衡

•復(fù)雜的動力學(xué)研究

•除非攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共表達(dá)，否則不適合低通透性的化合物

試驗(yàn)系統(tǒng)——肝細(xì)胞三明治模型

應(yīng)用

•評估肝臟攝取/外排和膽道排泄

•識別涉及肝膽藥物處置的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和限速步驟

•評估由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制而引起的藥物性膽汁淤積的可能性

•調(diào)查攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用

•評估藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度、Kpuu和亞細(xì)胞分布

優(yōu)勢

•系統(tǒng)模擬膽汁排泄，可以測量膽道清除率

•表達(dá)攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶和調(diào)節(jié)機(jī)制的整體系統(tǒng)

•可以使用從感興趣的物種中冷凍保存或新鮮分離的肝細(xì)胞

•適用于識別轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑（競爭性和非競爭性）和誘導(dǎo)劑

•在臨床前物種和人類中證明了體外對體內(nèi)的相關(guān)性

局限性

•需要一定的培養(yǎng)時間才能在合適的膜域中正確定位轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

•不太適合低清除率的化合物（特別是如果涉及代謝）

•酶/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)/活性可能會受到培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)把控

4.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)

目前，體外評估由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI的常用模型為膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和三明治培養(yǎng)肝細(xì)胞。在實(shí)際應(yīng)用過程中，我們需綜合多方因素，選擇合適的試驗(yàn)系統(tǒng)。當(dāng)進(jìn)行ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的體外研究時，以下幾點(diǎn)需要關(guān)注：

滲透性和吸附：當(dāng)評估轉(zhuǎn)運(yùn)體是否為在研藥物的底物時，若所測試藥物具有高滲透性或強(qiáng)非特異性吸附等特性，可能會因?yàn)楸尘爸递^高而造成假陰性的結(jié)果。如使用膜囊泡研究具有高滲透性活強(qiáng)非特異性吸附的藥物，可能會因?yàn)楸粍訑U(kuò)散跨膜進(jìn)入膜囊泡導(dǎo)致高背景，掩蓋轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致在囊泡模型中得到了假陰性的結(jié)果。

跨膜能力：如果在研藥物分子量大，不易透過細(xì)胞膜時，細(xì)胞模型將無法研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，而膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。藥物跨膜能力較差，能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的游離藥物濃度可能較低，而在膜囊泡模型中，藥物可以與轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合位點(diǎn)直接接觸發(fā)揮其作用，并不需要透膜的過程。

輔因子：在設(shè)計實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)考慮ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對共底物和輔因子的要求。例如，活細(xì)胞中以毫摩爾濃度存在的還原性谷胱甘肽是MRP1、MRP2、MRP2和MRP4轉(zhuǎn)運(yùn)某些底物所必需的；在某些情況下，谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。因此，試驗(yàn)中需額外添加適量的還原型谷胱甘肽或s -甲基谷胱甘肽。

4.2 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)

體外評估由SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI的常用模型為單向攝入的細(xì)胞系。當(dāng)使用單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行攝取研究時，以下幾點(diǎn)值得考慮：

溶解度：在試驗(yàn)設(shè)計時，應(yīng)考慮受試物的溶解度。為增加化合物的溶解度，可在不影響細(xì)胞活力或轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的情況下添加有機(jī)溶劑，如二甲基亞砜。對于溶解度低的化合物，可以在孵育緩沖液中加入白蛋白或其他賦形劑，但需要確定化合物處于未結(jié)合濃度，否則數(shù)據(jù)解釋將變得復(fù)雜。

試驗(yàn)程序：為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)過程需遵循一致的程序，盡量減小試驗(yàn)誤差導(dǎo)致的影響。攝取速率通常歸一化為細(xì)胞總蛋白（mg）或細(xì)胞數(shù)，以便與親代或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的攝取相比，準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性攝取。

孵育時間：為了確定受試物的抑制作用，需根據(jù)受試物特性，如滲透性、是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體底物等，考慮其與抑制劑的孵育時間（預(yù)孵育和/或共孵育）。

IPHASE轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)品

作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，IPHASE以HEK293為載體，成功推出全面匹配指導(dǎo)原則需求的SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞（OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡（P-gp和BCRP）及配套產(chǎn)品，助力藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的DDI研究。

參考資料：

[1]洪梅,王旭陽.藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后處置及相關(guān)關(guān)鍵位點(diǎn)研究進(jìn)展[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2022,43(06):160-172.

[2] Brouwer K L R , Keppler D , Hoffmaster K A ,et al.In vitro methods to support transporter evaluation in drug discovery and development.[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 94(1).DOI:10.1038/clpt.2013.81.

[3]《藥物相互作用指導(dǎo)原則2020》

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